08 Дек ПЦР-анализ, что это такое и почему он популярен?
ПЦР-анализ в реальном времени — термин, вошедший в обиход довольно неожиданно. Что такое метод ПЦР в реальном времени и почему о нем так много говорят в последние пару лет?
Судя по логике названия, это должна быть ПЦР в реальном времени, но тогда что такое ПЦР?
ПЦР расшифровывается как полимеразная цепная реакция. На самом деле это означает цепную, последовательную реакцию дублирования, в частности, в данном случае дублирование интересующей последовательности ДНК.
Чтобы по-настоящему понять гениальность метода ПЦР, вам нужно знать несколько вещей, которые уже общеизвестны сами по себе.
Вся информация о строительных кирпичиках, которые делают нас такими, какие мы есть, записана в наших генах, точнее в нашей ДНК.
ДНК, хотя и несет невероятное количество информации, записана всего 4 разными нуклеотидами. По сути, все, из чего состоит наше тело и обеспечивает его функционирование, пишется всего 4 буквами. Комбинация этих нуклеотидов, а точнее их последовательность, является основным элементом гена.
Что конкретно это означает для нас при объяснении термина ПЦР и ПЦР-анализ, так еще ничего.
Для того, чтобы связать это с репликацией, следует ознакомиться с самой структурой молекулы ДНК и с тем, как она упаковывается и как естественным образом реплицируется.
Нуклеотиды, буквы, которыми записывается код, расположены в последовательности и таким образом образуют цепь, которая для устойчивости всегда упакована попарно, двухцепочечно. Это стало возможным благодаря уникальному свойству нуклеотидов притягиваться друг к другу точно определенными парами. Один нуклеотид, буква, всегда будет в паре с точно определенной второй буквой, и это обеспечит не только стабильность самих цепочек, но и информацию, которую они несут.
Эта упакованная ДНК хранится в наших клетках. При ее использовании, точнее при ее использовании, информация, которую несет двухцепочечная структура, должна быть разделена на отдельные нити. Исключительно из-за легкого физического доступа к интересующим нуклеотидам.
Теперь, связывая это с нашей первоначальной темой и концепцией анализа ПЦР, это именно то, что происходит во время естественной репликации ДНК. Сначала должны развиться цепи, а затем нуклеотиды могут транскрибироваться без перерыва. В наших клетках эти процессы будут осуществляться ферментами, после чего цепи вернутся к своему двухцепочечному строению и все вернется в исходное состояние за исключением дуплицированного сегмента.
Реакция ПЦР воспроизводит именно эти процессы, только в контролируемых условиях, и это основа всех ПЦР-анализов.
Вместо фермента для разделения цепей используется повышенная температура. В то время как для собственно процесса включения нуклеотидов в новую цепь, переписывая последовательность, используется термостабильный фермент – полимераза.
Теперь вернемся к самому началу, и полимеразная цепная реакция звучит значительно понятнее, но все же нельзя сказать, что концепция ПЦР в реальном времени понятнее.
Таким образом, моделируя дублирование естественной последовательности, мы можем умножать цепочку ДНК столько раз, сколько захотим. Но цепь ДНК состоит из более чем 3 миллиардов нуклеотидов, нам просто нужно знать, что мы хотим умножить.
Здесь-то и выступает на первый план гениальное свойство нуклеотидов, заключающееся в том, что они взаимно притягивают друг к другу точно определенные комплементарные нуклеотиды.
При репликации первым шагом всегда является связывание исходной комплементарной последовательности с транскрибируемой цепью. Возможно, лучше смотреть на это так, как будто кто-то дал вам переписать целую книгу, но они написали за вас заголовки, и вы должны продолжать.
В клетках эту важную роль выполняют ферменты, и во время реакции ПЦР у вас есть возможность выбирать титры. Выбирая начальную последовательность нуклеотидов, вы также выбираете, какая часть цепочки ДНК будет скопирована.
Сейчас мы уже можем сказать, что у нас достаточно информации, чтобы предположить, почему этот метод так популярен. Помимо возможности амплифицировать сегменты ДНК, мы также можем выбирать, какие именно последовательности мы хотим амплифицировать и изучать позже.
Полимеразная цепная реакция — очень важное оружие каждого молекулярного биолога. Любой живой организм для исследования, даже некоторые организмы, которые нельзя назвать живыми. Умножая нужную часть цепочки, мы получаем большое количество копий последовательности, которую намереваемся исследовать или идентифицировать. Правильно подобрав праймеры, названия копий, мы можем точно различать гены, части гена, варианты гена и т. д.
Отсутствует только элемент реального времени, и мы можем сказать, что полностью понимаем название и функцию ПЦР в реальном времени.
Это отличное продолжение продолжения истории, так как что именно означает для нас большое количество копий нужной последовательности, невооруженным глазом уж точно не будет видно, а может быть и будет.
Компонент реального времени в названии метода относится к способности наблюдать за изменениями в реальном времени, в реальном времени.
Это достигается путем добавления флуоресцентно меченных зондов, коротких последовательностей нуклеотидов, букв, которые используют тот же феномен комплементарности для связывания с последовательностью-мишенью и включения ее в синтезируемую новую цепь.
Зонды не испускают сигнал, если они не связываются с целевой последовательностью, что означает, что если им не с чем связываться, сигнала не будет, а если они это сделают, то он будет. Кроме того, чем больше они связываются, тем сильнее сигнал.
Следовательно, перемножая искомую последовательность и ugсоздавая флуоресцентно меченые зонды, которые связываются с еще более специфическими последовательностями нуклеотидов внутри этих уже размноженных сегментов, мы получаем информацию о самом составе цепочек, точнее, знаем, какие буквы стоят в интересующих нас позициях.
Давайте теперь в последний раз посмотрим в самое начало текста, чтобы увидеть, можем ли мы теперь ответить на оба вопроса одним предложением.
